เพื่อตรวจจับปริมาณกรดอะมิโน 20 ชนิดในตัวอย่าง

การจัดเตรียมตัวอย่าง:

1. ไฮโดรไลซ์ตัวอย่างโปรตีนโดยให้ความร้อนด้วย 6N HCl ที่ 110°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงในหลอดที่ปิดสนิทเพื่อแยกโปรตีนออกเป็นกรดอะมิโนแต่ละตัว

2. กำจัด HCl โดยการระเหยภายใต้สุญญากาศ

3. ละลายไฮโดรไลเซตแห้งในตัวทำละลายที่เหมาะสม เช่น 0.1N HCl

4. กรองตัวอย่างผ่านตัวกรองเมมเบรน 0.45 μm

การวิเคราะห์ HPLC:

5. เลือกคอลัมน์การวิเคราะห์ C18 แบบย้อนกลับและเฟสเคลื่อนที่ที่เข้ากันได้ เช่น:

เฟสเคลื่อนที่ A: บัฟเฟอร์โซเดียมอะซิเตต 0.1 โมลาร์, pH 6.5
เฟสเคลื่อนที่ B: อะซีโตไนไตรล์/เมทานอล/น้ำ (45:45:10 ปริมาตร/ปริมาตร)

6. ตั้งโปรแกรมการชะล้างแบบเกรเดียนต์เพื่อแยกกรดอะมิโน เช่น 0-5 นาที 100% A, 5-30 นาที 0-100% B, 30-35 นาที 100% B

7. ตรวจจับกรดอะมิโนด้วยเครื่องตรวจจับ UV ที่ 254 นาโนเมตรหรือเครื่องตรวจจับเรืองแสงหลังจากการแปลงสภาพด้วยรีเอเจนต์ เช่น o-phthalaldehyde (OPA)

8. ระบุกรดอะมิโนโดยจับคู่เวลาการเก็บรักษากับเวลาของส่วนผสมกรดอะมิโนมาตรฐานที่ทำงานภายใต้สภาวะเดียวกัน

9. หาปริมาณกรดอะมิโนแต่ละตัวโดยการรวมพื้นที่พีคเข้าด้วยกัน และใช้เส้นโค้งการสอบเทียบที่เตรียมจากสารละลายกรดอะมิโนมาตรฐานที่มีความเข้มข้นที่ทราบ